中國藥典藥品微生物實驗室規范指導原則

   藥品微生物實驗室規范指導原則用于指導藥品微生物檢驗實驗室的質量控制。

     藥品微生物的檢驗結果受很多因素的影響，如樣品中微生物可能分布不均勻、微生物檢驗方法的誤差較大等。因此，在藥品微生物檢驗中，為保證檢驗結果的可靠性，必須使用經驗證的檢測方法并嚴格按照藥品微生物實驗室規范要求進行試驗。

     藥品微生物實驗室規范包括以下幾個方面：人員、培養基、菌種、實驗室的布局和運行、設備、文件、實驗記錄、結果的判斷等。

人員

      從事藥品微生物試驗工作的人員應具備微生物學或相近專業知識的教育背景。

      實驗人員應依據所在崗位和職責接受相應的培訓，在確認他們可以承擔某一試驗前，他們不能獨立從事該項微生物試驗。應保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必需的設備操作、微生物檢驗技術和實驗室生物安全等方面的培訓，經考核合格后方可上崗，同時，實驗室應制定所有級別實驗人員的繼續教育計劃。

     檢驗人員必須熟悉相關檢測方法、程序、檢測目的和結果評價。微生物實驗室的管理者其專業技能和經驗水平應與他們的職責范圍相符，如：管理技能、實驗室安全、試驗安排、預算、實驗研究、實驗結果的評估和數據偏差的調查、技術報告書寫等。

     實驗室應通過參加內部質量控制、能力驗證或使用標準菌株等方法客觀評估檢驗人員的能力，必要時對其進行再培訓并重新評估。當使用一種非經常使用的方法或技術時，有必要在檢測前確認微生物檢測人員的操作技能。

      所有人員的培訓、考核內容和結果均應記錄歸檔。

培養基

      培養基是微生物試驗的基礎，直接影響微生物試驗結果。適宜的培養基制備方法、貯藏條件和質量控制試驗是提供優質培養基的保證。

     1 ．培養基的制備

      培養基可按處方配制，也可使用按處方生產的符合規定的脫水培養基。

      在制備培養基時，應選擇質量符合要求的脫水培養基或單獨配方組分進行配制。脫水培養基應附有處方和使用說明，配制時應按使用說明上的要求操作以確保培養基的質量符合要求，不得使用結塊或顏色發生改變的脫水培養基。脫水培養基或單獨配方組分應在適當的條件下貯藏，如低溫、干燥和避光，所有的容器應密封，尤其是盛放脫水培養基的容器。商品化的成品培養基除了應附有處方和使用說明外，還應注明有效期、貯藏條件、適用性檢查試驗的質控菌和用途。

      為保證培養基質量的穩定可靠，各脫水培養基或各配方組分應準確稱量，并要求有一定的精確度。配制培養基&最&常&用的溶劑是純化水，特殊情況下，可能需要用去離子水和蒸餾水。應記錄各稱量物的重量和水的使用量。

      配制培養基所用容器和配套器具應潔凈，可用純化水沖洗玻璃器皿以消除清潔劑和外來物質的殘留，對熱敏感的培養基如糖發酵培養基其分裝容器一般應預先進行滅菌，以保證培養基的無菌性。

      脫水培養基應完&全溶解于水中，再行分裝與滅菌。配制時若需要加熱助溶，應注意不要過度加熱，以避免培養基顏色變深。如需要添加其他組分時，加入后充分混勻。應按照生產商提供或使用者驗證的參數進行培養基的滅菌。商品化的成品培養基必須附有所用滅菌方法的資料。培養基滅菌一般采用濕熱滅菌技術，特殊培養基可采用薄膜過濾除菌。

      培養基若采用不適當的加熱和滅菌條件，有可能引起顏色變化、透明度降低、瓊脂凝固力或pH 的改變。因此，培養基應采用驗證的滅菌程序滅菌，培養基滅菌方法和條件，應通過無菌性試驗和促生長試驗進行驗證。此外，對高壓滅菌器的蒸汽循環系統也要加以驗證，以保證在一定裝載方式下的正常熱分布。溫度緩慢上升的高壓滅菌器可能導致培養基的過熱，過度滅菌可能會破壞絕大多數的細菌和真菌培養基促生長的質量。滅菌器中培養基的容積和裝載方式也將影響加熱的速度。因此，應根據滅菌培養基的特性，進行全面的滅菌程序驗證。

      應確定每批培養基滅菌后的pH值（冷卻至室溫25 ℃ 測定）。若培養基處方中未列出pH 值的范圍，除非經驗證表明培養基的pH 值允許的變化范圍很寬，否則，pH值的范圍不能超過規定值士0.2 。

      制成平板或分裝于試管的培養基應進行下列檢查：容器和蓋子不得破裂，裝量應相同，盡量避免形成氣泡，固體培養基表面不得產生裂縫或漣漪，在冷藏溫度下不得形成結晶，不得污染微生物等。應檢查和記錄批數量、有效期及培養基的無菌檢查。

      2 ．培養基的貯藏

自配的培養基應標記名稱、批號、配制日期等信息，并在已驗證的條件下貯藏。商品化的成品培養基標簽上應標有名稱、批號、生產日期、失效期及培養基的有關特性，生產商和使用者應根據培養基使用說明書上的要求進行貯藏，所采用的貯藏和運輸條件應使成品培養基最&低限度的失去水分并提供機械保護。

      培養基滅菌后若貯藏在高壓滅菌器中，質量可能會受影響，一般不提倡這種存放法。瓊脂培養基不得在O ℃ 或O ℃ 以下存放，因為冷凍可能破壞凝膠特性。培養基應避光保存，若要長期保存，應置于密閉容器中以防止水分流失。瓊脂平板最好現配現用，如置冰箱保存，一般不超過1周，且應密閉包裝，若延長保存期限，保存期需經驗證確定。

      固體培養基滅菌后的再融化只允許1 次，以避免因過度受熱造成培養基質量下降或微生物污染。培養基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加熱。若使用微波爐，應避免培養基過度受熱及水分的蒸發，更要注意安全。融化的培養基應置于45 ～50 ℃ 的水浴中，不得超過8 小時。傾注培養基時， 應擦干培養基容器外表面的水分，避免容器外壁的水滴進人培養基中造成污染。

      使用過的培養基（包括失效的培養基）應按照國家污染廢物處理相關規定進行。

      3 ．質量控制試驗

      實驗室應對試驗用培養基建立質量控制程序，以確保所用培養基質量符合相關檢測的需要。

      實驗室配制或商品化的成品培養基的質量依賴于其制備過程，采用不適宜方法制備的培養基將影響微生物的生長或復蘇，從而影響試驗結果的可靠性。

      所有配制好的培養基均應進行質量控制試驗。實驗室配制的培養基的常規監控項目是pH 、適用性檢查試驗，定期的穩定性檢查以確定有效期。培養基在有效期內應依據適用性檢查試驗確定培養基質量是否符合要求。有效期的長短將取決于在一定存放條件下（包括容器特性及密封性）的培養基其組成成分的穩定性。

      除藥典附錄另有規定外，在實驗室中，若采用已驗證的配制和滅菌程序制備培養基且過程受控，那么同一批脫水培養基的適用性檢查試驗可只進行1 次。如果培養基的制備過程未經驗證，那么每一批培養基均要進行適用性檢查試驗，試驗的菌種可根據培養基的用途從相關附錄中進行選擇，也可增加從生產環境及產品中常見的污染菌株。

      培養基的質屋控制試驗若不符合規定，應尋找不合格的原因，以防止問題重復出現。任何不符合要求的培養基均不能使用。

      用于環境監控的培養基須特別防護，最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養基，那么在使用前應進行100 ％的預培養以防止外來的污染物帶到環境中及避免出現假陽性結果。

菌種

      試驗過程中，生物樣本可能是最敏感的，因為它們的活性和特性依賴于合適的試驗操作和貯藏條件。實驗室菌種的處理和保藏的程序應標準化，使盡可能減少菌種污染和生長特性的改變。按統一操作程序制備的菌株是微生物試驗結果一致性的重要保證。

      藥品微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的商業派生菌株。

      標準菌株的復活或培養物的制備應按供應商提供的說明或按已驗證的方法進行。從國內或國外菌種保藏機構獲得的標準菌株經過復活并在適宜的培養基中生長后，即為標準儲備菌株。標準儲備菌株應進行純度和特性確認。標準儲備菌株保存時，可將培養物等份懸浮于抗冷凍的培養基中，并分裝于小瓶中，建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30 ℃ ）等方法保存。低于-70 ℃ 或低溫冷凍干燥方法可以延長菌種保存時間。標準儲備菌株可用于制備每月或每周1 次轉種的工作菌株。冷凍菌種一旦解凍轉種制備工作菌株后，不得重新冷凍和再次使用。

       工作菌株的傳代次數應嚴格控制，不得超過5 代（從菌種保藏機構獲得的標準菌株為第0代），以防止過度的傳代增加菌種變異的風險。1 代是指將活的培養物接種到微生物生長的新鮮培養基中培養，任何亞培養的形式均被認為是轉種或傳代1 次。必要時，實驗室應對工作菌株的特性和純度進行確認。

       工作菌株不可替代標準菌株，標準菌株的商業衍生物僅可用作工作菌株。

       實驗室必須建立和保存其所有菌種的進出、收集、貯藏、確認試驗以及銷毀的記錄，應有菌種管理的程序文件（從標準菌株到工作菌株），該程序包括：標準菌種的申購記錄；從標準菌株到工作菌株操作及記錄，菌種必須定期轉種傳代，并做純度、特性等實驗室所需關鍵指標的確認，并記錄；每支菌種都應注明其名稱、標準號、接種日期、傳代數；菌種生長的培養基和培養條件；菌種保藏的位置和條件；其他需要的程序。

實驗室的布局和運行

      實驗室應具有進行微生物檢測所需的適宜、充分的設施條件。實驗室的布局與設計應充分考慮到良好微生物實驗室操作規范和實驗室安全的要求。實驗室布局設計的基本原則是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止檢驗過程對環境和人員造成危害?；顒訁^域的合理規劃及區分將提高微生物實驗室操作的可靠性。

      通常，實驗室應劃分成相應的潔凈區域和活菌操作區域，同時應根據試驗目的，在時間或空間上有效分隔不相容的試驗活動，將交叉污染的風險降低到最&低